真菌性肠炎的实验室检查--荧光染色

引起真菌性肠炎的病原主要是念珠菌，其次是曲菌、毛霉菌、组织胞浆菌、副球孢子菌和地丝菌等。偶见球孢子菌、马尔尼菲青真菌和新型隐球菌。

真菌性肠炎要与常见腹泻病进行鉴别，现将常见的真菌性肠炎实验室检查方法介绍如下：

真菌性肠炎的实验室检查：

1.病原学检查  由于真菌广泛分布于自然界，甚至空气中也常有孢子飞扬，采集粪标本和检查操作中，应尽可能减少污染，标本要新鲜。有些真菌传染性很强如荚膜组织胞浆菌，应注意安全防护，以免造成实验室人员感染。

(1)直接镜检标本：以10%氢氧化钾或生理盐水制片，高倍镜下发现大量菌丝和孢子有诊断意义。对于双相型真菌，仅查到孢子可能是正常带菌。真菌性肠炎的6种常见病原多数情况下直接镜检即可鉴定，但孢子、菌丝和其他背景物质有时相互混淆，不易辨认。

镜检诊断要点：

①菌丝和孢子：菌丝粗细一致，除毛霉菌外均有分隔，可见不同角度的分支，细胞质均匀，内含大小不等的颗粒。孢子多为圆形或卵圆形，多数大小一致，边缘整齐，可见细胞构造。

②细胞壁：在氢氧化钾溶液处理的标本中，细胞壁常变宽，连接成弧状，类似菌丝，但无菌丝的构造。

③石棉体：比菌丝更细，不分节，无菌丝颗粒。

④植物纤维：未消化的食物残渣，边缘不整，无分支。

⑤脂细胞：圆形，构造模糊，无细胞壁。

⑥磷脂小球：大小不一，形状不整，无细胞构造。

⑦氢氧化钾结晶：雪花样或珊瑚状，边缘呈锯齿形，折光性强。

⑧小水疱：圆形，透亮，无细胞构造。

(2)染色镜检常用的染色方法：

①革兰染色：适用于念珠菌，孢子、菌丝染成蓝色，但着色不均。

②过碘酸锡夫染色(PA5)：真菌孢子、菌丝均染成红色。

③真菌荧光染色：荧光显微镜下真菌孢子呈亮绿色。结构清晰，漏诊率低，容易观察。

④吉姆萨染色和瑞特染色：适用于荚膜组织胞浆菌，染色前用甲醇固定，油镜下菌体染成红色，较小一端有出芽，菌体周围有一圈荚膜样结构，为此菌的细胞壁。通常菌体位于巨噬细胞或单核细胞内，少数位于细胞外。

⑤乳酸酚棉蓝染色：适用于各种真菌培养涂片，菌体染成蓝色。

(3)真菌培养：粪标本直接镜检通常不容易确定菌种，需参考粪培养结果，观察菌落形态，再挑取菌落染色后镜检。常用沙保培养基和血琼脂培养基。对于双相型真菌还需在不同温度下(25℃或37℃)分别培养，以便观察其形态改变。

①大培养：是鉴别真菌的主要方法之一，可观察菌落的生长情况。根据菌落的生长速度、形态、色泽等，初步判别菌种。

A.试管斜面：用白金环刺破琼脂平面，分3点将标本接种于试管斜面培养基上。此法不易污染，但菌落较小。

B.培养皿：分3点将标本接种于平皿培养基中央，倒置后放恒温箱中培养，每3天观察1次菌落生长情况。

②小培养：将大培养中生长较好的菌落接种在玻片培养基上。培养1～3天后，在显微镜下观察菌体的特征。

A.点片法：先将少许培养基成形于载玻片中央，再将菌种接种于培养基边缘。覆以盖玻片，置于有U形管的玻璃平皿中，培养后于不同时间取出镜下观察或染色镜检。

B.压片法：将菌种接种在试管斜面或平皿培养基上，覆一盖玻片，以便菌体向盖玻片上生长，然后于适当时间取出置于载玻片上镜检。

2.组织病理学检查：有些真菌属于人肠道内正常菌群，如白念珠菌。且真菌污染问题广泛存在，所以粪标本病原学检查的诊断价值有限，有时需结合肠镜活检结果综合判断。

(1)曲菌感染的病理变化：具有诊断意义，包括：

①炎症：急性渗出性炎症。

②溃疡形成：由于曲菌侵犯血管，引起血管破坏，出现血栓和组织坏死；溃疡大小不一，形态各异，可深达肌层，底面粗糙不平，有脓性渗出。

③肉芽肿：由上皮细胞和巨噬细胞组成，伴有中性粒细胞、淋巴细胞或浆细胞浸润。

④化脓性改变：黏膜下小脓肿形成，大量中性粒细胞浸润，其中可见菌丝。

(2)病理切片中发现真菌孢子和菌丝，是侵袭性肠炎的直接证据，有肯定的诊断意义。染色方法包括：

①过碘酸锡夫染色：真菌呈红色。

②乌洛托品银染色：真菌呈黑色。

③真菌荧光染色：真菌呈黄绿荧光。

3.免疫学检查

(1)真菌菌素皮肤试验：用念珠菌、曲菌、组织胞浆菌、副球孢子菌等真菌的菌素或菌苗，按不同的稀释比例做皮肤过敏试验，48h后出现直径大于5mm硬结或红斑为阳性，对于诊断临床症状不典型的患者，有参考价值。

(2)血清抗原检测：病原真菌被人体吞噬细胞等处理降解后，细胞壁和细胞浆抗原游离于血循环中，未被清除者可经酶免疫法(EIA)、间接血凝试验、免疫印迹法等检测。加热休克蛋白属于真菌胞浆抗原。Walsh等对肿瘤并发侵袭型念珠菌病，于发病后24h内检测有50%阳性，特异性高达96%。又如用ElA法检测曲菌肠炎患者血清中的细胞壁抗原和能与刀豆素A结合的相关抗原，有早期诊断价值，定量检测抗原水平达100μg/ml时，可对真菌培养阴性者做出确诊。

(3)血清抗体检测：补体结合试验对诊断组织胞浆菌肠炎有一定价值，可参考皮肤试验结果综合判断以排除假阳性。间接荧光素标记抗体定量试验可用于诊断念珠菌肠炎。此外，尚有对流免疫电泳、乳胶凝集试验、ELA等常用方法，以后者最为敏感。但对于艾滋病等伴有免疫功能抑制的患者，抗体检测容易出现假阴性。

(4)猬集反应(cumping reaction)：念珠菌病患者血清内有一种猬集因子和抑制猬集现象的干扰物，前者可抑制由念珠菌在试管中的活力。血清猬集反应在正常人普遍存在，但感染念珠菌后，由于干扰物增多，猬集现象被抑制。

4.动物接种试验  对于粪标本真菌培养的菌落，其致病性如何，可进一步通过动物接种加以鉴定。

(1)接种方法：刮取培养基上的菌落，研碎，加生理盐水稍加震荡，滤去菌丝，制成孢子混悬液，浓度为108/ml左右，注入动物体内。根据动物的大小及接种途径，剂量0.2～1.0ml不等，可反复多次接种以加强对动物的致病性。

(2)动物的选择与接种途径：因菌种不同，对动物的感染性也不同，应选择适当的动物和不同的接种途径：

①白念珠菌：选用兔静脉注射或小鼠腹腔注射。

②曲菌：选用兔、小鸡静脉或腹腔注射。

③毛霉菌：选用兔静脉注射。

④组织胞浆菌：菌液加5%胃黏液素，选用大鼠或小鼠腹腔注射。

⑤副球孢子菌：选用豚鼠睾丸内注射。

⑥地丝菌：对动物不致病。

(3)动物解剖：解剖前将动物放入5%苯酚溶液中消毒，然后在无菌条件下检查相应组织、器官的病

其他辅助检查：

利用气相色谱法测定血清中真菌代谢产物或分解产物浓度，对诊断侵袭型真菌性肠炎有一定参考价值。如念珠菌胞壁上的甘露聚糖经水解后产生甘露糖，其血清浓度在念珠菌菌血症常大于800μg/ml，念珠菌肠炎在600～800μg/ml之间，正常人低于600 μg/ml。现代分子生物学技术飞速发展也为深部真菌病的诊断开辟了新的途径。核配探针杂交和PCR技术，可测定真菌的特异性基因片段，敏感、快速，目前国内外均已开展。如Buchman等报道，念珠菌羊毛固醇去甲基酶的编码基因，为真菌特异性基因片段，通过PCR法检测可用于临床诊断深部真菌病。